RIPA裂解液（Western Blot）

（一）貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1、取 RIPA(強(qiáng))裂解液置室溫融解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。
2、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液清洗 1 次，低速離心，棄上清，留取沉淀。
3、按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的 RIPA(強(qiáng))裂解液，移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接
觸。置于冰上或 4℃裂解，通常裂解液作用于細(xì)胞 1～3s 內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
4、10000～12000g，4℃離心 5～10min（如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可），取上清。
5、后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
（二）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1、取 RIPA(強(qiáng))裂解液置室溫融解混勻后，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。
2、低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

3、用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的 RIPA(強(qiáng))裂解液，如果細(xì)
胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明
顯的細(xì)胞沉淀。
4、10000～12000g，4℃離心 5～10min（如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可），取上清。
5、進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
（三）組織樣本
1、 取 RIPA(強(qiáng))裂解液置室溫融解混勻后，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。
2、把組織弄成細(xì)小的碎片，越小越好。
3、 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速研磨，研磨過(guò)程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋
白的降解。
4、 按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例，加入含有 PMSF 的裂解液，冰上或 4℃裂解 15～30min。
5、 步驟 3、4 亦可以采用如下過(guò)程：按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 RIPA(強(qiáng))
裂解液。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過(guò)程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。
6、10000～12000g，4℃離心 5～10min（如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可），取上清。
7、進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

1. 為取得佳的使用效果，盡量避免過(guò)多的反復(fù)凍融。
2. 抽提蛋白的所有步驟都需在冰上或 4℃進(jìn)行。
3. 建議在臨用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF，使 PMSF 的終濃度為 1mM。PMSF 可以向我公司訂購(gòu)。
3. 在貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的操作步驟中，去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不用清洗。
4. 如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。
5. 如果細(xì)胞量較多，必須分裝成 50~100 萬(wàn)細(xì)胞/離心管然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞
由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)容易裂解充分。
6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液中裂解，通過(guò)強(qiáng)烈 vortex 使樣品裂解充分。然
后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設(shè)備，缺點(diǎn)是不如勻漿
器或研磨那樣裂解得比較充分。
7. 如果希望獲得更好的裂解效果，細(xì)菌和酵母可以分別使用破壁酶消化，然后再使用本裂解液進(jìn)行裂
解。
8. RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的
復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢
測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
9. 復(fù)融后的試劑請(qǐng)及時(shí)使用，避免裂解液中有效成分失效。
10. 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住
宅內(nèi)。
11. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。